外源基因在細胞中的表達可分為兩大類,一類是瞬時表達,外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中,雖然可以達到高水平的表達,但通常只持續(xù)幾天;一類是穩(wěn)定表達(構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株),外源DNA整合到宿主細胞染色體上,使宿主細胞可長期表達目的基因。
建立穩(wěn)定細胞株,基本原理是將外源DNA克隆到具有某種抗性的載體上,載體被轉(zhuǎn)染到宿主細胞并整合到宿主染色體中,用載體中所含的抗性標志進行篩選,得到可穩(wěn)定表達目的蛋白的細胞株。
示例:MSLN過表達細胞株的構(gòu)建
1. 過表達人MSLN蛋白(Q13421)的慢病毒載體構(gòu)建,其結(jié)構(gòu)圖如圖 1所示:
Fig.1 MSLN慢病毒載體圖譜
2. 將制備的慢病毒載體及慢病毒包裝質(zhì)粒PspaX2、PMD2 .0G轉(zhuǎn)染293T細胞,包裝72小時后回收病毒;
3. 檢測病毒滴度,以三種不同的滴度感染CHO-K1宿主細胞,24小時后更換培養(yǎng)基;
4. 以未感染慢病毒的CHO-K1細胞(以下稱為CHO-K1-blank)為陰性對照組,以感染慢病毒的CHO-K1細胞(以下稱為CHO-K1-MSLN)cell pool為實驗組,各組加入不同的藥物濃度加壓篩選,選取適當?shù)乃幬餄舛群髷U大培養(yǎng)4-5代。
5. 以梯度稀釋法在96孔板中培養(yǎng)CHO-K1-MSLN細胞,5天后觀察細胞生長并挑選單克隆細胞進行擴大培養(yǎng)。
6. 取2E5擴大培養(yǎng)的單克隆細胞,F(xiàn)ACS buffer洗兩遍后加入陽性檢測抗體(220812A01)[1],如下圖所示,流式細胞術(shù)檢測MSLN蛋白的表達。
流式檢測MSLN表達
費洛斯的慢病毒感染篩選穩(wěn)定細胞株平臺基于載體中所含的抗性標志進行篩選,常用的真核表達載體的抗性篩選標志物有新霉素(neomycin)、潮霉素(hygromycin)和嘌呤霉素(puromycin),篩選得到可穩(wěn)定表達目的蛋白的穩(wěn)定細胞株,為基礎(chǔ)研究(基因功能研究)、藥物篩選(CAR開發(fā)前期scFv篩選)等提供科研助力。
[1]. Yuchun Gu, Le Yin. A kind of CAR-NK cell preparation method of target mesothelin[P].China.
[2].CN109762844A.2019.05.17